Humboldt-Universit?t zu Berlin

From Dusk till Dawn: One-Plasmid Systems for light regulated Gene Expression

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Zusammenfassung

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Ein grundlegendes Prinzip der wissenschaftlichen Erforschung biologischer Systeme im Labor ist die gezielte Ver?nderung bestimmter Parameter und die Untersuchung der dadurch hervorgerufenen Effekte. Auf Ebene der Zelle werden diese Ver?nderungen durch Deletion, ?berexpression oder Mutation einzelner Gene sowie durch Applikation pharmakologischer Wirkstoffe erreicht. Diese Methoden weisen jedoch entweder einen Mangel an Spezifit?t oder Geschwindigkeit auf. In der Optogenetik werden genetisch kodierte, lichtsensitive Proteine zur Kontrolle zellul?rer Prozesse mit hoher zeitlicher und r?umlicher Aufl?sung verwendet. Von besonderem Interesse für optogenetische Anwendungen sind sensorische Photorezeptoren, das hei?t Proteine, die Lichtsignale aus der Umgebung in eine biologische Antwort innerhalb der Zelle umwandeln. Die funktionelle Vielfalt natürlicher Photorezeptoren und die M?glichkeit neue, synthetische Photorezeptoren zu konstruieren, erlaubt die Regulation zellul?rer Signalwege verschiedenster Art.

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In meiner Arbeit wurde der synthetische Photorezeptor YF1 zur lichtregulierten Expression von Zielgenen in Escherichia coli verwendet. In Abwesenheit von Blaulicht aktiviert YF1 das Adapterprotein FixJ, welches wiederum die Genexpression durch den FixK2 Promotor induziert. Diese Komponenten sind im Plasmid pDusk vereint und führen in Abwesenheit von Blaulicht zur Expression von beliebigen Genen die in das System integriert werden. Die Applikation von Blaulicht hingegen führt zur Inaktivierung von YF1 und folglich auch der Genexpression in pDusk. Durch Einfügen einer zus?tzlichen Genkassette wurde das komplement?re System pDawn konstruiert, welches durch Blaulicht aktiviert wird. In vivo l?sst sich die Genexpression und deren gegens?tzliche Lichtabh?ngigkeit in pDusk und pDawn durch die Verwendung eines Gens, welches ein rot fluoreszierendes Protein kodiert, quantifizieren. W?hrend in pDusk die Genexpression durch Blaulicht maximal um den Faktor 12 reprimiert wird, kommt es in pDawn zu einer 460-fachen Induktion durch Blaulichtapplikation. Dieser gro?e dynamische Bereich von pDawn ist vor allem durch eine extrem geringe Hintergrundaktivit?t bedingt. Quantitative Messungen der roten Fluoreszenz einzelner Zellen mit Hilfe von Durchflusszytometrie zeigen eine bin?re und konzertierte Schaltung beider Systeme innerhalb von Zellpopulationen. Das Niveau der Genexpression kann dabei in pDusk sowie pDawn durch Variation der Blaulichtintensit?t oder der Beleuchtungszeit pr?zise adjustiert werden. Im Vergleich zu bisher publizierten lichtregulierten Genexpressionsystemen sind pDusk und pDawn unabh?ngig ?von externen Kofaktoren und bieten hohe Induktionsfaktoren. Wie in meiner Arbeit gezeigt, kann insbesondere pDawn zur Proteinproduktion im pr?parativen Ma?stab verwendet werden. Da die Induktion von Genexpression durch Licht kosteneffizient und leicht zu automatisieren ist stellen beide Systeme nützliche Werkzeuge für die biotechnologische Industrie dar. Durch die M?glichkeit genetische Komponenten und Genprodukte in der Zelle pr?zise und nicht-invasiv durch Lichtapplikation zu kontrollieren erlauben pDusk und pDawn darüber hinaus die gezielte Erforschung zellul?rer Signalwege in vivo.