Franziska Schneider
Humboldt-Preis für ihre Diplomarbeit
Modifikationen an Volvox-Kanalrhodopsin 1 zur Verbesserung von Expression und Farbverschiebung
In ihrer Arbeit zeigt Frau Schneider, wie man Fragmente verschiedener Kanalrhodopsine kombinieren kann, um Hybride mit neuen Eigenschaften zu generieren. Für die Grundlagenforschung erlaubt das neue Einblicke in die Funktionsweise in die erst kürzlich entdeckte Klasse licht gesteuerter Ionenkan?le. Damit hat Frau Schneider einen wichtigen Beitrag für die Entwicklung des noch jungen Gebietes der Optogenetik geleistet.
Zusammenfassung
Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierbare Kationenkan?le, die als Fotorezeptoren in Grünalgen wirken. Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine geh?renden Proteine weisen sieben typische Transmembranhelizes auf und binden über eine Schiffsche Base das Carotinoid-Derivat Retinal. Durch Lichtabsorption isomerisiert all-trans Retinal in die 13-cis-Kofiguration. Infolgedessen ?ndert sich die Proteinkonformation und es bildet sich ein Kanal, durch den haupts?chlich Protonen, aber auch andere ein- und zweiwertige Kationen passiv transportiert werden.
Da ChRs lichtinduziert Membranen depolarisieren, werden sie als optogenetische Hilfsmittel zum Ausl?sen von Aktionspotentialen in Neuronen verwendet. Das durch blaues Licht (460 nm) aktivierte Chlamydomonas Kanalrhodosin 2 (ChR2) konnte für vielf?ltige Untersuchungen von neuronalen Netzwerken und deren funktionalen Zusammenh?ngen verwendet werden. Durch ChR2-Aktivierung in spezifischen Neuronen von Caenorhabditis elegans, Drosophila und M?usen konnten gezielt Verhaltens?nderungen hervorgerufen werden. ChR2-Expression in Ganglien- oder Bipolarzellen der Retina blinder M?use konnte deren Photosensitivit?t bei hohen Lichtintensit?ten wiederherstellen. Um die neurowissenschaftlichen Anwendungen auszubauen, ist ein in Bezug auf ChR2 l?ngerwellig absorbierendes ChR dringend erforderlich. Volvox Kanalrhodopsin 1 (VChR1) kann durch grünes Licht (Maximum 548 nm) angeregt werden. Aufgrund seines geringen Expressionslevels in Neuronen sind seine Anwendungsm?glichkeiten bisher jedoch sehr eingeschr?nkt.
In der vorliegenden Diplomarbeit wurden verschiedene Strategien zur Verbesserung der VChR1-Expression getestet. Die untersuchten Proteine wurden als Fusionsproteine mit dem cyan-fluoreszierenden Protein in HEK-Zellen exprimiert, so dass Expressionsniveau und Membranst?ndigkeit in konfokalen Fluoreszenzaufnahmen visualisiert werden konnten. Zus?tzlich wurde eine Methode zum Vergleich der elektrophysiologisch gemessenen Fotostromamplituden entwickelt. Durch die Einführung der Punktmutation H129R sowie durch terminale Ver?nderungen konnten die Stromamplituden von VChR1 signifikant erh?ht werden. Der Austausch einzelner Helizes gegen die homologen Sequenzen aus Volvox Kanalrhodopsin 2 (VChR2) oder ChR2 führte zu einer Verbesserung der Membranst?ndigkeit der Proteine.
Es wurde versucht, Aminos?uren, welche die Absorptionseigenschaften der ChRs beeinflussen, zu identifizieren. Die Punktmutation F221Y sowie der Austausch der sechsten und siebten Helix führten zu einer Blauverschiebung des Anregungsspektrums von VChR1. Dagegen konnte durch Austausch der dritten und vierten Helix gegen die homologen Helizes von ChR2 eine Rotverschiebung erreicht werden.
Die vorliegende Arbeit zeigt M?glichkeiten und Schwierigkeiten bei der gezielten Ver?nderung von ChRs auf. Sie bildet die Grundlage für die Entwicklung optimaler ChRs für spezfische Anwendungen in den Neurowissenschaften.