DFG-Sachbeihilfe: Hochleistungs-Auxiliare für eine cysteintolerante native chemische Peptidverknüpfung an beliebigen Aminos?uren

Durch die Native Chemical Ligation (NCL) von ungeschützten Peptidthioestern mit ungeschützten Cysteinylpeptiden gelingt es, Proteine in definierter posttranslationaler Modifizierung darzustellen. Allerdings schr?nkt die Notwendigkeit für Cystein die Anwendungsbreite der NCL ein. Zwar erweitert die gegenw?rtig h?ufig verwendete Ligations-Entschwefelungs-Methode das Repertoire der NCL-Reaktionen, allerdings ist der Aufwand zur Etablierung der Mercaptoaminos?urebausteine zu hoch, um beliebige Ligationsschnittstellen erschlie?en zu k?nnen. Nachteilig ist auch, dass Cysteinreste, die nicht an der NCL teilnehmen sollen, geschützt werden müssen. Bei NCL-Methoden, die auf der Verwendung von Auxiliargruppen beruhen, ist nur ein einziger Baustein n?tig, der im Idealfall auf beliebige Verknüpfungsstellen anwendbar sein sollte. Die bislang dokumentierten Auxiliare sind jedoch entweder sterisch zu aufwendig, so dass Verknüpfungen nur an Glycin-Schnittstellen gelingen, oder die Abl?sung des Auxiliars zieht ungeschützte Cysteinseitenketten in Mitleidenschaft. Ziel dieses Vorhabens ist es, die erste allgemein anwendbare Methode zu entwickeln, welche unabh?ngig von der Ligationsstelle eine rasche Verknüpfung der Peptidfragmente erm?glicht und in Gegenwart von ungeschützten Cysteinresten eingesetzt werden kann. Wir werden Hochleistungsauxiliare entwickeln, die i) an einer beliebigen kommerziellen Aminos?ure im letzten Schritt der Festphasenpeptidsynthese eingeführt werden k?nnen; ii) in der NCL hohe Reaktivit?t auch an sterisch aufwendigeren Verknüpfungsstellen vermitteln; iii) unter milden Bedingungen ohne Nebenreaktionen rasch abgel?st werden k?nnen, ohne hierbei iv) ungeschützte Cysteinreste zu beeintr?chtigen. Um diese Ziele zu erreichen, werden wir mit 2-Seleno-2-phenethyl- und 2-Mercapto-2-arylethyl-Gerüsten neue Auxiliarklassen etablieren. Die Auxiliare sind haben geringen sterischen Anspruch, so dass NCL-Reaktionen über einen 5-gliedrigen ?bergangszustand sehr rasch ablaufen werden. Unter radikalischen Bedingungen wird eine Fragmentierungsreaktion ausgel?st, die das Zielprotein liefert, ohne unbeteiligte Cysteinseitenketten zu behelligen. Bei der Proteintotalsynthese werden mit Leu-Thr-, Gln-Asn-, Leu-His- und Ile-Met-Kupplungen erstmals Ligationsschnittstellen etabliert, die existierenden Methoden der Native Chemical Ligation bislang verwehrt bleiben. Die Nützlichkeit der Methode wird in der Totalsynthese von SH3-Dom?nen der Adapterproteine p130Cas und NEDD9 erprobt. Die Funktionalit?t der Zielproteine wird in Bindungsexperimenten mit bekannten Liganden dokumentiert. Durch die Totalsynthese/ und Charakterisierung ortsspezifisch phosphorylierter p130Cas- und NEDD9-Proteinen werden wir ergründen, ob die SH3-Dom?nen einen ?Phosphoschalter“ haben, mit dem das Erkennungsrepertoire und damit die zellul?re Signaltransduktion reguliert werden kann.