SPP 1784: Zellul?re Bildgebung der RNA-C-zu-U-Editierung

Die RNA-Editierung beeinflusst das RNA-Splei?en und die Proteintranslation. Die jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung haben eine zunehmende Anzahl an mRNA-Editierungsstellen offenlegen k?nnen. Diese Methoden erbringen einen ?berblick über den Editierstatus eines Ensembles an Zellen. Hingegen ist über die Dynamik, Zellspezifit?t und Regulation der mRNA-Editierung wenig bekannt. Auch ist unklar, ob die Lokalisation der RNA durch Editierung beeinflusst wird. Diese Wissenslücken sind auf das Fehlen geeigneter Methoden zur Echtzeit-RNA-Analyse in Zellen zurückzuführen, denn die gebr?uchlichen RNA-Bildgebungsverfahren bieten nicht die Sequenzspezifit?t und Sensitivit?t, die für eine Bildgebung editierter RNA n?tig w?re. Um die methodologische Lücke zu schlie?en, werden wir fluorogene Oligonukleotid-Sonden entwickeln, die ein Fluoreszenzsignal nur dann liefern, wenn die Hybridisierung mit matched (z.B. editierter) mRNA, nicht aber mit mismatched (z.B. nicht editierter) mRNA stattfindet. Wir werden auf Forced Intercalation (FIT)-Sonden zurückgreifen. In diesen nimmt ein Farbstoff aus der Thiazolorange (TO)-Familie die Stelle einer kanonischen Nukleobase ein. FIT-Sonden liefern bei Hybridisierung einzelnukleotidspezifische Anstiege der Fluoreszenzemission. Für eine eineindeutige Typisierung des RNA-Editierzustands wird eine FIT-Sonde den editierten Zustand (z.B. GlyR α2 c.656U) abfragen, w?hrend eine zweite konkurrierende und unterschiedlich farbige FIT-Sonde den nicht editierten Zustand (z.B. GlyR α2 c.656C) anzeigt. Durch zus?tzlicher Farbstoffe und Helfersonden werden wir die Sequenzspezifit?t und das Ansprechverhalten weiter verbessern. Homo-Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) werden wir nutzen, um fehlpaarungssensitive Energiesenken einzuführen. Hetero-FRET mit TO-?hnlichen Farbstoffen wird bei breitbandiger Anregung die Helligkeit der Signale erh?hen. Die hier untersuchte C→U-Editierung der mRNA für den Glycin-Neurotransmitterrezeptor (GlyR) bewirkt einen Funktionszugewinn des Proteins und kann zu kognitiver Dysfunktion und Angstverhalten führen. Unsere Studien legen nahe, dass dies jedoch vom Nervenzelltyp abh?ngt, in dem die RNA-Editierung hochreguliert ist. Ziel ist es also, die Dynamik und m?gliche Nervenzelltypspezifit?t der Editierung von mRNA für den GlyR zu erfassen. Hierfür werden wir die Visualisierung der GlyR-RNA-Editierung mit immunchemischen Methoden zur Nervenzelltypbestimmung und funktionellen Analysen auf Einzelzellniveau kombinieren. Nach anf?nglichen Untersuchungen an fixierten Prim?rneuronen, in denen Epitop-markierte GlyR-mRNA (HA und MS2 oder BOTO) in editierter und nicht editierter Form exprimiert wird, werden wir neuronal-endogene GlyR-kodierende RNA in fixierten und lebenden Prim?rkulturen des Hippokampus sowie in Hirnschnittpr?paraten vom Tiermodell der Epilepsie nachweisen. Die vorgeschlagenen Arbeiten werden funktionale Studien zur Regulation der RNA-Editierungsmaschinerie erm?glichen.