SPP 1926/1: Entwicklung und Anwendung neuer optogenetischer Werkzeuge in spezifischen intrazellul?ren Kompartimenten

Ziel unserer Arbeiten im Rahmen dieses Projektes ist es, neue optogenetische Anwendungen zur Erforschung subzellul?rer Kompartimente zu entwickeln. Im ersten Teilprojekt werden wir lichtgesteuerte Protonen- und Chloridkan?le bzw. Chloridpumpen mit Targetingsequenzen kombinieren, um eine organell-spezifische Expression in synaptischen Vesikeln (SV) oder Lysosomen zu erreichen. Dazu werden wir den kürzlich von uns publizierten Ansatz zur optogenetischen Ans?uerung dieser Organellen mittels der lichtaktivierten Protonenpumpe Arch3 nutzen. Um eine akute Depletion von Protonen aus SV bzw. Lysosomen zu erreichen, werden wir einen durch Mutagenese erzeugten Arch3-basierten Protonenkanal verwenden. Für die Manipulation der luminalen Chloridkonzentration werden wir chloridleitende Kanalrhodopsine oder licht-aktivierte Chloridpumpen implementieren. Als Targetingsequenzen werden wir das Tetraspanin Synaptophysin für SV bzw. CD63 für Lysosomen verwenden. Die lichtgesteuerten Aktuatoren werden mit genetisch kodierten, optischen Indikatoren für den luminalen pH oder die Membranspannung kombiniert, welche zuvor biophysikalisch charakterisiert und verbessert werden. Alle Konstrukte werden mittels Lentiviren oder Adeno-assoziierten Viren in prim?ren Neuronenkulturen exprimiert und elektrophysiologisch sowie durch funktionelle Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Die von uns entwickelten Proteine werden detaillierte Untersuchungen der Ionenhom?ostase in endolysosomalen Kompartimenten in lebenden Zellen erm?glichen. Im zweiten Teilprojekt werden wir pr?synaptisch-exprimierte lichtaktivierbare Adenylylzyklasen entwerfen, mittels derer optogenetische Untersuchungen von pr?synaptischer Langzeitpotenzierung (LTP) m?glich werden. Die bakterielle photoaktivierbare Adenylylzyklase bPAC wird mit verschiedenen pr?synaptischen Proteinen fusioniert, und ihre Funktion in heterologen Expressionssystemen sowie ihre Lokalisation in Neuronen getestet. Im n?chsten Schritt wird der Effekt von pr?synaptischer bPAC-Aktivierung auf synaptische Transmission in autaptischen Kulturen von hippocampalen K?rperzellen untersucht, welche wir als in-vitro Modell für pr?synaptisches LTP etabliert haben. Daran anschlie?end werden wir die Anwendung der pr?synaptischen bPAC auf hippocampale Schnittkulturen übertragen und den Einfluss von bPAC-Aktivierung auf die Transmission von Moosfasersynapsen untersuchen. Mittels stereotaktischer Injektion von Adeno-assoziierten Viren in den Gyrus Dentatus werden wir danach die pr?synaptische bPAC in vivo exprimieren und ihre Funktion in akuten hippocampalen Schnittpr?paraten demonstrieren. Die M?glichkeit, durch Licht pr?synaptisches LTP in genetisch definierten Neuronen auszul?sen wird unter anderem neue M?glichkeiten zur Untersuchung der molekularen Mechanismen von pr?synaptischem LTP er?ffnen. Darüber hinaus wird dieser Ansatz neue in-vivo Studien zum Einfluss von pr?synaptischem LTP auf Lernen, Ged?chtnis und Verhalten erm?glichen.