SPP 1926: Entwicklung und Anwendung von RoCK, einem neuen Rhodopsinzyklase/K+-Kanal-basierten optogenetischen Werkzeug zur Inhibierung erregbarer Zellen

Die Optogenetik erlaubt es, biologische Prozesse mithilfe von Licht mit bisher nie dagewesener r?umlich-zeitlicher Kontrolle zu steuern, um das Verhalten von Zellen, Netzwerken oder lebenden Tieren zu beeinflussen. Im Gegensatz zur Erfolgsgeschichte ?erregender‘ Rhodopsinvarianten ist die Effektivit?t erregungshemmender optogenetischer Werkzeuge verbesserungsbedürftig. Hierzu haben wir in der ersten Projektphase des SPP1926 einen Licht-aktivierbaren K+-Kanal (PACK) entwickelt. PACK verbindet eine lichtgesteuerte Adenylylzyklase (PAC) mit einem cAMP-gesteuerten K+-Kanal (SthK). PACK inhibiert Aktionspotenziale in Neuronen von Maus und Zebrafisch in vitro und in vivo, und hemmt die Aktivit?t von Kaninchen-Kardiomyozyten. Die Vorteile von PACK gegenüber anderen hemmenden Werkzeugen sind: i) Unterdrückung der elektrischen Erregbarkeit, basierend auf Aktivierung einer K+-Leitf?higkeit, ?hnlich nativer Zellinhibierung, wodurch Ruhemembranpotenzial und native Ionengradienten erhalten bleiben, ii) hervorragende Photonenbilanz, da kurze (10 ms) Lichtimpulse moderater Intensit?t ausreichen, um Aktionspotenziale für >60 s zu unterbinden. Allerdings schr?nkt die langsame ,Off-Kinetik‘ (aufgrund langlebiger PAC-Photozyklusintermediate) die Anwendbarkeit von PACK zur Untersuchung zellul?rer Erregbarkeit im (Sub-)Sekunden- Bereich ein. Au?erdem k?nnte der interne Botenstoff von PACK, cAMP, auch andere zellul?re Signalwege beeinflussen. In der zweiten Projektphase des SPP1926 m?chten wir diese Nachteile überwinden und ein neuartiges optogenetisches System entwickeln, das cGMP als Botenstoff verwendet. Dafür werden wir eine Rhodopsinguanylylzyklase mit einem cGMP gesteuerten K+-Kanal kombinieren (RoCK). In Vorversuchen haben wir die kürzlich charakterisierte Rhodopsinguanylylzyklase aus Caterina anguillulae und einen konstruierten cGMP-abh?ngigen Sthk-Prototypkanal in Neuroblastoma-/DRG-Zellen sowie in einer Kardiomyozytenzelllinie exprimiert. Kurze Lichtpulse initiieren Str?me vergleichbarer Amplituden wie mit PACK, aber mit einer mehr als 10x schnelleren Off-Kinetik. Wir planen, RoCK weiterzuentwickeln, indem wir optimierte Enzym- und Kanalversionen selektieren oder konstruieren. Wir werden rot-verschobene und pr?synaptisch lokalisierte RoCK Varianten herstellen. Zun?chst werden wir diese in Zelllinien, prim?ren Neuronen, und Kardiomyozyten in vitro testen. Au?erdem planen wir, RoCK zur transienten, optischen Ablation von Vorhofflimmern in intaktem Herzgewebe in-situ zu nutzen. Schlie?lich werden wir mit RoCK das Verhalten von Spinalneuronen und retinalen Ganglienzellen von Zebrafischen in vivo untersuchen. Wir erwarten, dass RoCK ein vielseitig einsetzbares optogenetisches Werkzeug mit Potential zur Verwendung in Neurowissenschaften, Herzforschung, und darüber hinaus darstellt.