Untersuchung der Photochemie der BLUF Dom?ne durch ortsgerichtete Einführung von Isotopenmarkierungen in Flavin und Protein

BLUF Doma?nen (Blue light sensors using FAD) enthalten einen bisher wenig verstandenen Flavin Kofaktor, der in ein Wasserstoffbru?ckennetzwerk eingebettet ist, welches sich in Picosekunden nach Belichtung reversibel umordnet. Der daraus resultierende Signalzustand aktiviert eine assoziierte Enzymdoma?ne oder einen Signaltransduktionspfad. Die molekularen Einzelheiten der prima?ren licht-induzierten Wasserstoffbru?ckenumordnung sowie die resultierenden Signalprozesse sollen mit Hilfe von Schwingungsspektroskopie aufgekla?rt werden. Zeitaufgelo?ste Schwingungsspektren werden dazu im Bereich von Picosekunden (Pump-Probe) und Minuten (FTIR) aufgenommen. Bisher wurde die Interpretation solcher Spektren aufgrund der Schwierigkeit der Bandenzuordnung behindert. Durch Einfu?hrung von ortsgerichteten Isotopenmarkierungen an Aminosa?urenseitenketten sowie am Flavinkofaktor werden die zugeho?rigen Banden verschoben und damit identifiziert. Mit diesem Vorgehen werden wir ein auf molekularer Ebene detailliertes Modell der Photoaktivierung in BLUF Doma?nen erstellen. Selektiv markierte Proteinproben werden in speziellen E. coli Sta?mmen hergestellt, die zuvor mit entsprechenden Auxotrophien versehen wurden. Zur Markierung des Flavinkofaktors wird ein Riboflavin auxotropher Stamm verwendet, der ein genomisch verankertes Riboflavin-Aufnahmesystem besitzt. Durch Zufu?tterung von Riboflavinisotopomeren werden diese selektiv in die produzierten Proteine eingebaut. Die Kombination von Flavin- und Proteinisotopenmarkierung mit state-of-the-art Spektroskopie wird deutlich zum Fortschritt in der BLUF Forschung beitragen und neue Perspektiven fu?r Proteininfrarotspektroskopie aufzeigen.